什么是 dTAG？

dTAG（降解 TAG）是一種創(chuàng)新型靶標確認方法，該方法使用異雙功能小分子降解劑來調(diào)控細胞的蛋白降解系統(tǒng)以及清除目標蛋白。dTAG 系統(tǒng)由 Dana Farber 癌癥中心的 Behnam Nabet 博士及其同事共同開發(fā)，是一種可被廣泛推廣的方法，也是一種靶蛋白降解 (TPD)的方式。在開發(fā)降解劑的過程中，PROTAC ®  MZ 1（類別號 6154）和 THAL SNS 032（類別號 6532）等其他 TPD 方法使用一種已與 E3 連接酶配體相連的靶蛋白的已知配體。dTAG 技術(shù)通過降解劑技術(shù)和基因組工程的結(jié)合，從而消除了對已知配體的需要。

dTAG 是如何工作的？

圖 1：dTAG 的作用機理

通過CRISPR/Cas9 介導的基因座特異性敲入或慢病毒轉(zhuǎn)基因表達，靶蛋白表達為一種具有 FKBP12F36V 突變體的嵌合體。dTAG-13（類別號 6605）等 dTAG 化合物由一個高選擇性 FKBP12F36V 配體與 E3 連接酶配體連接組成，該配體在融合蛋白和 E3 連接酶之間形成一個三元復合體，從而引起靶蛋白多聚泛素化和降解。

在體外，dTAG-13 經(jīng)證實會導致 BRD4-FKBP12F36V 的快速有效降解，但對內(nèi)源性野生型 FKBP12、BRD2 或 BRD3 水平?jīng)]有影響。為驗證此方法，還將 dTAG 系統(tǒng)用于與 EZH2、HDAC1、KRAS、MYC 和 PLK1 融合的 FKBP12F36V 的蛋白嵌合體。還使用一種熒光素酶-FKBP12F36V 嵌合體在體內(nèi)對 dTAG-13 的療效進行了驗證。這種融合蛋白最初在一種人白血病細胞系中表達，隨后被移植到小鼠骨髓中。dTAG-13 會導致生物發(fā)光信號迅速減少，這表明其能有效降解熒光素酶-FKBP12F36V 嵌合體。

dTAG 在癌癥中用于靶標確認

常規(guī)的靶標確認策略包括使用RNA 干擾 (RNAi) 或 CRISPR/Cas9破壞基因表達從而導致細胞總蛋白水平降低 ，或使用小分子拮抗劑抑制蛋白功能。小分子等藥理學方法較單純的基因方法具有許多優(yōu)勢，包括劑量依賴性效應以及快速且可逆的作用。相比之下，基因方法提供的動態(tài)控制較少、無法確定效應量且通常不可逆。使用 dTAG 進行靶標確認結(jié)合了基因和藥理學策略的關(guān)鍵優(yōu)勢，能對細胞總蛋白豐度提供快速的劑量依賴性效應，而且這種效應在降解劑洗脫方面是可逆的。

dTAG-13 已被用來檢測和驗證癌癥的新靶點。含有 YEATS 結(jié)構(gòu)域的蛋白 ENL 是超級延伸復合體 (SEC) 的一部分，該復合體可通過增加 RNA 聚合酶在轉(zhuǎn)錄期間的催化速率來控制轉(zhuǎn)錄延伸級別的基因活動。該蛋白先前已被確定為急性髓系白血病 (AML) 中的一種關(guān)鍵蛋白，可通過維持基因表達失調(diào)來支持發(fā)病機制，然而，并無已知可用于 ENL 的配體。

為驗證 ENL 作為 AML 中的一種靶標，Erb 等人將 ENL 表達為人體 AML 細胞系中的一種 FKBP12F36V 融合蛋白并在納摩爾濃度下通過 dTAG-13 證實了 ENL 的選擇性降解。這導致了轉(zhuǎn)錄起始和延伸的全基因組抑制以及細胞生長停滯。使用 dTAG-13 降解 ENL 的進一步研究表明其在 SEC 募集中發(fā)揮作用，并將 YEATS 結(jié)構(gòu)域確定為一種對 ENL 依賴性細胞生長至關(guān)重要的染色質(zhì)識別域的效應分子。