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混合技術(shù)利用 Ni-NTA-Nanogold®_闡明亞蛋白結(jié)構(gòu)

更新時間:2023-06-30      點擊次數(shù):893

TFIIF是一種由兩個保守亞基組成的通用轉(zhuǎn)錄因子,可與RNA聚合酶II (RNAPII)緊密結(jié)合,調(diào)節(jié)真核生物中信使RNA的合成。在此,結(jié)合了電子顯微鏡(EM) 和福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的混合方法(FRET) 被描述并用于定位 RNAPII-TFIIF 結(jié)構(gòu)中第二個 TFIIF 亞基 (Tfg2) 的 C 末端。在第一階段,附加到 Tfg2 C 末端的多聚組氨酸標(biāo)簽用鎳-NTA 納米金進(jìn)行標(biāo)記,并設(shè)計了七步單粒子 EM 方案以獲得納米金可在 3D 中訪問的區(qū)域,表明 Tfg2 C -末端靠近RNAPII的夾子。接下來,選擇與夾子相鄰的RNAPII的Rpb2和Rpb4亞基的C端放置FRET衛(wèi)星以實現(xiàn)納米定位(NP)分析,從而提高定位精度,使得Tfg2 C發(fā)現(xiàn)-末端駐留在夾脊上,但在轉(zhuǎn)錄過程中可以移動到夾頂部。因為接受 EM 或 FRET 探針的標(biāo)簽可以很容易地引入到任何蛋白質(zhì)亞基,這種混合方法通常適用于補(bǔ)充許多蛋白質(zhì)復(fù)合物的納米精度冷凍電鏡研究。


混合技術(shù)利用 Ni-NTA-Nanogold®

闡明亞蛋白結(jié)構(gòu),
揭示關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制

一種新的混合技術(shù)結(jié)合了 Ni-NTA-Nanogold® 標(biāo)記、用于單顆粒分析的創(chuàng)新雙離焦成像與冷凍電鏡以及 FRET——在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)繪圖中實現(xiàn)納米級精度。該小組使用這種強(qiáng)大的方法來闡明 DNA 轉(zhuǎn)錄機(jī)制關(guān)鍵組件的結(jié)構(gòu)和功能,甚至揭示了這些部分在與 DNA 相互作用以物理啟動轉(zhuǎn)錄時的運動。

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